PCR實驗代測的模板濃度

 服務內容：

1.制定個性化實驗方案：根據(jù)不同的實驗目的確定實驗方案、選定合適的內參；

2.檢測類別：mRNA、miRNA、lncRNA、DNA；

3.樣本抽提及質檢：對客戶提供樣本進行RNA抽提，并利用NanoDrop進行樣本質檢；

4.定量PCR預實驗：包括樣本反轉錄為CDNA、配置PCR反應體系及進行Real-TimePCR反應；

5.正式定量PCR實驗：根據(jù)預實驗結果進行正式實驗；

6.數(shù)據(jù)分析：采用2- △△CT法進行分析，比較不同樣本間差異。

影響Ct值的關鍵因素

模板濃度

模板濃度是決定Ct的最主要因素?？刂圃谝粋€合適范圍內，使Ct在15-35之間

反應液成分的影響

任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。

PCR反應的效率

PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續(xù)梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產(chǎn)生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。

Real-time qPCR常見參數(shù)

基線（baseline）通常是3-15個循環(huán)的熒光信號

同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線

閾值（threshold）

自動設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍

手動設置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強

同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。

Ct值:與起始濃度的對數(shù)成線性關系。

分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。

Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。

△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結果（△Rn=Rn-基線）。

如何評估實時定量PCR反應的效果

PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復，至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。

另一個評估PCR效率的關鍵參數(shù)是相關系數(shù)R2，它是說明兩個數(shù)值之間相關程度的統(tǒng)計學術語。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來準確預測X值（量）。如果R2等于0，你就不能通過Y值來預測X值。R2值大于0.99 時，兩個數(shù)值之間相關的可信度很好。

PCR實驗代測的模板濃度